技术要点说明

关于如何设计引物

请确保引物与模板相匹配，两者不匹配会导致测序结果不佳。 设计引物参数如下：

• 引物长度应在18-24bp之间
• 退火温度（Tm）应在50-60℃之间
• GC含量在45-55%之间
• 3′端含一个G或C
• 3′端的序列与模板严格互补

提示：引物的单位是pmol/µl=µM

关于如何纯化PCR产物

建议您选用商业化的试剂盒进行切胶纯化，纯化的产物溶解在灭菌水中。

如果您的PCR产物存在非特异条带，请务必在送样前进行切胶纯化。

如果您的样品是单一条带，安升达将为您提供纯化服务。建议您对样品提前进行纯化，我们会对已纯化样品进行优先安排测序。

关于如何设定Sanger测序的模板浓度（针对预混合服务）

对质粒来说，模板的浓度就是模板的碱基长度（kb）乘以10ng/µl
即最佳质粒浓度=10 ng/µl×kb。
例如：您有一个4.5kb长的质粒（载体+插入片段），将质粒的长度（kb）扩大10倍，也就是说，该质粒最佳的测序浓度为45ng/µl。
因为我们需要10µl的模板量，因此您需要提交给我们450ng的质粒。


对纯化的PCR产物来说，测序模板的浓度为模板的长度（kb）乘以2ng/µl。
即纯化的PCR产物的最佳浓度=2ng/µl×kb。
例如：您的PCR产物为700bp，将它的kb数扩大2倍。也就是说，该PCR纯化产物的最佳测序浓度为1.4 ng/µl。
因为我们需要10µl的模板量，因此您需要提交给我们14ng的PCR纯化产物。